Проточно-инжекционный анализ (ПИА) является одним из наиболее автоматизированных, производительных и экспрессных методов современной аналитической химии и используется в различных областях промышленности, экологическом контроле, в фармокологии и медицине для определения содержания токсичных соединений, микрокомпонентов, интермедиатов химических превращений и т. д. Одним из оясновных достоинств ПИА, обеспечивающим широкое использование метода, является возможность комбинирования стадий пробоотбора, разделения и концентрирования, способа конечного детектирования и обработки полученных результатов анализа в одном миниатюрном приборе, что позволяет существенным образом упростить проведения рутинных аналитических процедур. Целью настоящего раздела является обзор основных этапов возникновения и совершенствования ПИА, областей его применения и приборного оснащения метода.

Важным этапом развития методов автоматизации аналитических процедур явился метод проточного анализа в сегментированном потоке, предложенный в работе [1] в 1957 г. Пузырьки воздуха, вводимые в поток, обеспечивали смешивание потоков пробы и растворов реагентов для ускорения достижения равновесного состояния. Положенная в основу метода работа при равновесных условиях существенно ограничивала производительность анализа. Замена сегментированного потока на несегментированный при проведении анализа была реализована в 1975 г. Я. Ружичкой в методе, получившим название ПИА [2].

Согласно первому определению, ПИА — метод, основанный на введении жидкой пробы в движущийся несегментированный непрерывный поток жидкости-носителя. Инжектированная (введенная) проба образует зону, которая транспортируется к детектору, непрерывно измеряющему оптическую плотность, потенциал или другой физический параметр, а также его изменение, вызванное прохождением зоны пробы через детектор.

Три основных принципа ПИА: комбинирование инжекции (ввода) пробы, контроль дисперсии зоны пробы и контроль времени взаимодействия.

Позднее были предложены следующие определения ПИА [3]:

ПИА — метод получения информации на основании градиента концентраций, образованного в результате инжектирования точно определенной зоны жидкости в непрерывный несегментированный поток носителя. При этом основные отличительные черты ПИА сохраняются: воспроизводимый ввод пробы и точно контролируемые действия с зонами проб и реагентов (за счет жесткого контроля времени) и получение аналитического сигнала при термодинамически неравновесных условиях.

ПИА — нехроматографическая технология проточного количественного анализа, осуществляемая с помощью воспроизводимых вводов зон проб и реагентов в поток носителя при термодинамически неравновесных условиях.

На сегодняшний день опубликованы монографии [4–9] и обзоры [10, 11], посвященные технике осуществления ПИА, теории и методическому обеспечению методов.

На рис. 12.1. представлена схема осуществления ПИА с нерерывной подачей раствора-носителя. В ПИА отклик есть результат двух противоположных процессов: разбавление пробы, вызванное движением зоны введенной пробы вследствие дисперсии в потоке носителя и увеличение концентрации продукта реакции во время движения от места ввода к детектору.

В ПИА на стадии ввода пробы реализуется так называемый «прямоугольный» ввод, обеспечивающий определенную стартовую точку начальной концетрации

Рис. 12.1. Схема осуществления ПИА:
Р — перистальтический насос; S — проба; D — детектор;
W — сброс; T — время до регистрации максимума пика;
t — время анализа; S↓ — ввод пробы; H — высота пика;
A — площадь аналитического пика

и начальный момент времени анализа. Для того, чтобы оценить насколько сильно размывается первоначально введенная зона пробы во время ее движения к детектору, сколько времени проходит между моментом ввода пробы и получением сигнала вводится понятие коэффициента дисперсии зоны пробы (D), как отношения концентраций компонента до (с⁰) и после (с) дисперсионного процесса, протекающего в элементарной зоне жидкости, обусловливающей получение аналитического сигнала:

D = с⁰ / с.

В реальной системе, где аналитическим сигналом является высота пика, для оценки D рассматривается отношение с⁰ к концентрации внутри единичного слоя жидкости, соответствующей максимуму концентрационного пика (с^max). Таким образом, устанавливается связь между с^max и первоначальной концентрацей введенной пробы (или реагента):

 = /.

Первоначально гомогенная зона пробы размывается во время ее прохождения к детектору. При этом первоначально прямоугольный профиль зоны с концентрацией c⁰ изменяется к непрырывному градиенту концентраций с максимальной концентрацией с^max в вершине пика (рис. 12.2). Необходимо заметить, что для любого отклика детектора, если D = 2, проба разбавляется потоком раствора реагента в объемном соотношении 1 : 1.

Дисперсия пробы в ПИА является воспроизводимой и контролируемой. В трубках с диаметром 0,3–1,5 мм i.d., обычно используемых в ПИА (в отсутствие пузырьков воздуха случайная турбулентность отсутствует) имеет место только молекулярная диффузия вследствие конвекции из-за различия в скоростях потока в различных точках поперечного сечения трубки. При этих условиях не требуется достижение равновесия для получения воспроизводимых результатов. Основными факторами, влияющими на дисперсию являются:

• объем пробы;

• скорость потока носителя;

• соотношение скоростей потоков носителя пробы и раствора реагента;

• геометрические размеры и конфигурация ПИА-устройств;

• вязкость жидкости, температура и т. д.

Рис. 12.2. Схема размытия зоны в ПИА от начального «прямоугольного» ввода до максимума пика

Дисперсия зоны пробы в ПИА может быть разделена на три следующих типа:

1) ограниченная (или предельная) (1 ≤ D > 2),

2) средняя (D = 2–10),

3) большая (D = 10–10000).

Как правило, в ПИ-системах преимущественно реализуется ограниченная дисперсия зоны пробы, поскольку желательно, чтобы зона пробы достигала детектора с минимальным размытием. Форму пика при ограниченной дисперсии, обусловливающей более крутые (чем в случае других дисперсий) передний и задний края пика, иллюстрирует рис. 12.3.

Рис. 12.3. Форма пика при реализации ограниченной диффузии в ПИА

Предельная дисперсия в ПИА используется:

• для измерения рН и электропроводности;

• при автоматическом вводе пробы в ААС или ИСП-приборы;

• при выполнении кинетических измерений;

• во время биоанализов на живых клетках.

В случае ограниченной диффузии объем вводимой пробы и размеры соединительных трубок существенным образом влияют на дисперсию зоны пробы и вид отклика детектора. Высота пика увеличивается с увеличением объема вводимой пробы до достижения определенного постоянного значения сигнала. Дальнейшее увеличение объема вводимой пробы не приводит к увеличению высоты пика, но существенным образом увеличивает ширину пика, что иллюстрируется рис. 12.4, а. Дисперсия зоны введенной пробы в ПИА (при постоянных скорости потока носителя и внутреннего диаметра трубки) увеличивается с удлинением используемых трубок (рис. 12.4, б). Поэтому для проведения анализа необходимо уменьшить длины соединительных трубок между узлом ввода пробы и детектором.

Средняя дисперсия (СД) зоны пробы проявляется в типичных ПИ-пиках, когда вершина пика соответствует 50–10% начальной концентрации пробы (рис. 12.5). СД наиболее широко распространена в ПИА, поскольку большинство ПИ-схем определения компонентов включают смешение зон пробы и реагента с целью получения детектируемого продукта реакции. Таким образом, включение в гидравлическую схему анализа смесительных спиралей или узлов смешения между инжектором и детектором приводит к анализу в условиях СД.

Рис. 12.4. Изменение соединительной аналитического сигнала при увеличении объема вводимой пробы
от 60 до 800 мкл (а) и при удлинении трубки (L)
от 20 до 250 мм (б)

Рис. 12.5. Средняя дисперсия зоны пробы в ПИА

При уменьшении объема вводимой пробы и удлинении соединительной трубки между инжектором и детектором можно реализовать условия ПИ-анализа с большой дисперсией пробы (рис. 12.6). В этом случае имеет место интенсивное разбавление зоны пробы, концентрация в максимуме пика составляет 0–10% от первоначальной концентрации (c^max << c⁰), что используется при анализе высоко концентрированных проб.

Рис. 12.6. Большая дисперсия зоны пробы в ПИА

Геометрия соединительных устройств и эффективность смешивания также влияют на дисперсию зоны пробы и, соответственно, форму отклика детектора. Чаще всего работают с трубками внутреннего диаметра 0,2–0,8 мм (наиболее часто — 0,5 мм), 10 мкл пробы распределяются на длине — 10 см. В прямой трубке дисперсия зоны пробы является результатом ламинарного потока жидкости, в котором скорость движения центральной части потока в два раза выше его средней скорости, тогда как слои вблизи стенок движутся существенно медленнее средней скорости потока. Это приводит к ассиметричному градиенту концентраций и получению пика с размытым задним фронтом (В). В результате прохождения смесительной спирали форма пика становится симметричной (с).

Таким образом, форма зоны пробы на пути от ввода к детектору изменяется от первоначально прямоугольной, образованной в инжекторе, через ассиметричную в Гауссовскую форму, формируемую в смесительных спиралях (рис. 12.7).

Рис. 12.7. Изменение формы зоны пика в ПИА во время ее движения в смесительной спирале

Одним из способов увеличения радиального смешения жидкости является использование трубок с твердыми инертными наполнителями (например, стеклянными шариками). Однако, недостатком этого способа является большое значение отношения поверхность/объем, что может вызывать нежелательную для ПИА адсорбцию компонентов на поверхности наполнителя.

Необходимо отметить, что при выполнении ПИА с одним потоком носителя (или раствора реагента), в который вводится проба большого объема, возможна ситуация получения двойных пиков, вызванная тем, что вследствие низкой дисперсии реагент не достигает центра зоны пробы. При ПИА с несколькими потоками носителей и растворов реагентов, наличие узлов смешения и смесительных спиралей предотвращает подобную ситуацию. Однако, использование нескольких потоков требует применения многоканального насоса бльшего количества реагентов, увеличивает объемы отходов.

Одним из важнейших факторов, определяющих высокую воспроизводимость результатов ПИА является строгий контроль времени взаимодействия компонентов пробы и реагента с образованием продукта реакции, который регистрируется проточным детектором. В частности, необходимостью поддержания строго воспроизводимых временных интервалов между инжектированием пробы и прохождением детектора объясняется постепенный переход в ПИА от первоначально использовавшихся перистальтических насосов к шприцевым, обеспечивающим большее постоянство скоростей потоков.

В случае непрерывного потока временное различие между инжектором и детектором задается скоростью потока, объемом и геометрией соединительных устройств. Использование более длинных трубок приводит к увеличению времени взаимодействия аналита и реагента, с одной стороны, но, с другой, — к разбавлению продукта реакции.

Рис. 12.8. Схема реализации ПИА с остановкой потока

Преимуществами ПИА с остановкой потока являются:

1) повышение чувствительности анализа вследствие измерения аналитического сигнала от большего количества детектируемого вещества, образовавшегося во время остановки потока;

2) возможность получения информации о кинетике протекающих реакций на основании тангенса угла наклона кривой скорости реакции;

3) уменьшение расходования реагентов и отходов анализа;

4) уменьшение объема необходимой для анализа пробы;

5) сокращение гидравлической схемы анализатора, особенно между инжектором и детектором, что важно при разработке микро-анализаторов ПИА.

Однако, при реализации данной схемы ПИА для получения воспроизводимых результатов более жесткие требования предъявляются к насосу.